Historique des produits Fractals:
Les Nigelles

C’est en 1998 que notre intérêt s’est porté sur l’huile de la Nigella Sativa L.

Nous nous sommes intéressés, tout au début, à son application et celui des ses composants principaux en cancérologie, ceci au vu des multiples publications à ce sujet. (1) (6) (15)

Les principales composants de l’huile de nigelle obtenue par pression à froid sont les suivants : Acides linoléiques (polyinsaturés) 59% environ selon la provenance de l’huile, Acides oléiques (mono-insaturés) 23-25% et Acides Palmitiques (saturés ) 12 % (3)

Cette huile comporte principalement  des composés phénoliques et des quinones : Thymoquinone (TQ), diThymoquinone (DTQ), thymohydroquinone (THQ) et thymol (THY) (2) (3) (5)

La densité de cette huile est d’environ 0,921 Gr/cm3 (4).

Les quinones, étant l’élément essentiel actif de la plante, représentent 30 à 48% des constituants principaux de la Nigella sativa (3) (8). Nous avons donc décidé de nous concentrer dessus. 

L’idée de départ (1998) :

Extraire des nanobulles ou nanoparticules de cette huile avec une puissante agitation mécanique (2000 Watts/ 3 cm de course) . Il est à noter que l’appellation “nanoparticules” ne s’applique qu’aux particules ayant des tailles en dessous des 100 nanomètres .

En effet, en biologie, des tailles de particules en dessous des 100 nm peuvent passer la barrière membranaire très facilement. (7) (11),

Il est évident qu’à travers le monde plusieurs études ont porté sur les nanoparticules de Thymoquinone. Cependant, nous avons opté pour des nanoparticules d’huile totale ayant toutes ses composés. 

C’est grâce à une étude menée en Belgique, que nous avons pu constater des particules ayant des tailles variant de 20 nm à 200 nm.

Une première expérience in vitro à été entreprise en France sur des cellules A546. Sur 175 boîtes de pétri, en alternant chaque 5 boîtes de liquide nourrissant (glucose, acides aminés, vitamines, solution saline, antibiotiques) nous avons introduit notre solution dynamique d’huile de Nigelle .

Le résultat est le suivant :  au bout du 5ème jour d’observation, les cultures des boîtes ayant reçu la solution avec nos nanoparticules d’huile de nigelle se sont désagrégées.

Nous avons reproduit cette expérience dans un autre laboratoire, 4 fois sur 5, notre Nigelle dynamique détruisait les cellules A546 in vitro au bout de cinq jours.

Les multiples publications à propos de la Thymoquinone issue de la Nigella Sativa et son action anticancéreuse (1) (6) nous ont appris que les quinones sont la clé de l’action anticancéreuse de la Nigella Sativa.

De nombreuses études ont mis en avant l’utilité de la Thymoquinone en tant qu’acteur principale de l’action de la Nigella sativa dans divers domaines en médecine (cancérologie, infectiologie, dermatologie, cardiologie, neurologie, …) (12)

La difficulté expérimentale in vivo avec cette huile réside dans son absorption, sa quantification, son dosage et la biodisponibilité qui peuvent différer d’une personne à une autre ou d’une graine à une autre selon sa provenance.  

D’où l’orientation de la recherche scientifique particulièrement vers la Thymoquinone.

La Thymoquinone

La Thymoquinone fût isolée pour la première fois en 1963 par El Dahakhni (10).

La Thymoquinone  à l’état pure est fragile quant à sa manipulation, elle est sensible au PH, à la chaleur et la lumière, elle est très hydrophobe et peu soluble. (9)

Et la recherche fût orientée vers les nanoparticules qui non seulement garantissent une bonne pénétration intracellulaire mais aussi la capacité de traverser la paroi hémato encéphalique 

Nanoparticules

Selon les normes suivantes :

• –ISO (International Organisation for Standardisation),
• -ASTM (American Society of Testing and Materials),
• -NIOSH (National Institute of Occupational Safety and Health),
• -SCCP (Scientific Committee On Consumer Products)
• -BSI (British Standards Institution),
• -BAuA (Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin),

Définition d’une nanoparticule : 

Une nanoparticule doit avoir des dimensions comprises entre 1 et 100 nm.

Le premier à avoir utilisé les nanoparticules fût le Professeur Peter Paul Speiser, de l’Institut Fédéral de Technologie à Zurich, qui a travaillé sur la vectorisation des vaccins en 1960 .

Dans les années 2000 « l’Abraxane ®» fût le premier médicament commercialisé reposant sur les nanoparticules (13)

L’un des principal domaine d’usage des nanoparticules est celui des cancers, avec des tentative de ciblage de toxicité dirigé vers les site néoplasiques (14)

Nous avons tant bien que mal essayé de comprendre le mode d’action du Nigelle 5 sur les cellules A546, cependant les seules réponses que nous avions étaient d’ordre mathématiques ou théoriques. Jusqu’en 2003 où les différentes publications à propos des nanoparticules émergeront. Par la suite, nous avons pu générer des nanoparticules par agitation mécanique dans un rapport volumétrique de 1/100 . 

De ce fait, la biodisponibilité de cette huile ne nécessite plus le passage par un tractus digestif, elle peut être immédiatement biodisponible dès le passage buccal, juste en entrant en contact avec le plancher de la sphère buccale. Nous avons compris que l’enjeu de la biodisponibilité est bien supérieur avec notre méthode, ce qui facilite pénétration des nanoparticules à travers les récepteurs membranaires.(17) 

Thymoquinone et nanoparticules :

Dans les pathologies inflammatoires, et certaines maladies pulmonaires à titre curatif et même prophylaxique, les nanoparticules de la Thymoquinone sont plus efficaces que la Thymoquinone seule isolée et pure.

Une élaboration de différentes tailles et types de nanoparticules a permis d’adresser les thérapeutiques sur des sites différents selon la pathologie pulmonaire. (16)

« Fabrication » des nanoparticules en industries pharmaceutiques et recherches:

Il existe plusieurs méthodes de fabrication ou d’isolement de nanoparticules. Les deux principales familles sont les Bottoms Up et les Top Down. 

La première est de constituer synthétiquement la ou les molécules partant de l’échelle atomiques moléculaire pour arriver à la nanoparticule. 

La deuxième consiste à partir d’une substance de départ pour isoler des structures cristallines nanoparticulaires. Ceci nécessite l’emploie des gros moyens tels que de grandes pressions et procédés mécaniques tels que le broyage, la sono précipitation par des ultrasons, etc.  afin d’arriver à une échelle nanométrique.

Nous avons soupçonné l’existence de ces petites parcelles observables en microscope dès 2003, de nos jours des publications multiples ont confirmé notre hypothèse de départ.  Toute substance naturelle possède ses propres nanoparticules. 

Le fait de vortexer l’huile de Nigelle dans un volume donné (eau et éthanol)  engendre la manifestation de nanoparticules d’huile de Nigelle, offrant une nouvelle perspective de biodisponibilité d’où la rapidité de l’action. 

Ces particules se comportent tantôt comme particules tantôt comme onde (expérience des Fentes de Young). 

Documentation : Quelques références concernant l’utilité de la Thymoquinone

La Thymoquinone, principal constituant de la Nigella sativa a démontré des activités anti-inflammatoires, anti-oxydantes, anti-tumorales et antimicrobiennes (Banerjee et al., 2009 ; Chaieb et al., 2011).

La Thymoquinone (principe actif) et l’extrait de Nigella sativa se sont révélés efficaces contre le virus de la grippe aviaire (H9N2) et sur un modèle expérimental d’infection à cytomégalovirus murin ( Salem et Hossein, 2000 ; Umar et al., 2016) .

Le traitement des cellules avec l’extrait de Nigella sativa avant l’infection par le coronavirus diminue la réplication du virus (Ulasli et al., 2014).

L’analyse de l’expression génique des protéines potentielles des récepteurs transitoires (TRP) a montré une réduction des charges virales lors des traitements d’extraits ce qui peut diminuer la survie des coronavirus à l’intérieur des cellules (Heinrich et al., 2020 )

La Thymoquinone pure a dévoilé une remarquable activité anti-sepsis et immuno-modulatrice à des doses spécifiques (Alkharfy et al., 2018 ; Alkharfy et al., 2015 ; Alkharfy et al., 2011 ).

La Thymoquinone module la production d’oxyde nitrique (NO) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), et protège contre le syndrome de défaillance multiviscérale (SDMV) ou multiple organ dysfunction syndrome (MODS).

Ces ROS (radicaux superoxyde, peroxyde d’hydrogène et radicaux hydroxyle) sont produits, entre autre, par la xanthine oxydase et les oxydases NADH+/NADPH+ (Galley, 2011 ; Ichinose et al., 2007 ).

Les Oxydases NADPH+, la NO synthase inductible (iNOS) et les mitochondries sont considérées comme des médiateurs importants de ROS dans la sepsis et le dysfonctionnement cardio-vasculaire (Kirkeboen & Strand, 1999 ; Munzel, Gori, Bruno, & Taddei, 2010 ; Tsolaki et al.,2017 ).

Le sepsis est caractérisé par une libération accrue de NO (dont la synthèse dépend de l’oxydation de l’arginine en citrulline, de la forme inductible de la NOS et de sa forme endothéliale) qui est en corrélation avec un dysfonctionnement systémique et des lésions tissulaires chez les humains et les animaux (Rabuel et al., 2010 ; Tsolaki et al ., 2017 ).

Le NO peut interagir avec l’absorption du Ca dans les myocytes et entraver son activité contractile ( Forstermann & Sessa, 2012 ).

Le NO joue un rôle clé dans l’inflammation systémique du sepsis, la vasodilatation, la perméabilité vasculaire altérée et l’extravasation, la migration des leucocytes et l’activation (Ince et al., 2016).

La Thymoquinone permet une diminution des cytokines inflammatoires (Interleukines et TNF), réduit le niveau de NO et ainsi permet une amélioration des fonctions des organes (foie et rein principalement) (Alkharfy et al., 2015 ), et ce grâce à un mécanisme redox qui diminue le stress oxydatif systémique et la réponse inflammatoire.

La Thymoquinone diminue les niveaux des biomarqueurs précoces du sepsis (ESM-1,CRP, VEGF) d’environ 30 à 50% (Alkharfy et al., 2018).

La Thymoquinone possède également un effet protecteur contre la fibrose pulmonaire induite chez le rat et le dépôt de collagène en modulant la signalisation du facteur nucléaire Kappa-B (NF-KB) et des protéines antioxydantes : facteur nucléaire-2 et hème oxygénase-1 (Nrf2/HO-1) (Ahmad et al., 2020).

L’activation des phagocytes induite par le virus est corrélée au stress oxydatif, non seulement parce que des ROS sont produits, mais parce que les phagocytes activés produisent également des cytokines inflammatoires par l’activation de NF-KB ( SF Lui et Malik, 2006 ; Schwarz, 1996).

De nombreux gènes régulés par NF-KB, y compris les cytokines inflammatoires COX2 ET iNOS, contribuent à une augmentation des réponses inflammatoires de le sepsis ( Ghosh et al., May,& Kopp, 1998 ; Schneider-Srock et al., 2014 ).

L’inhibition de NF-KB peut supprimer les gènes inflammatoires, entraver les cytokines er réduit l’infiltration et l’activation des cellules inflammatoires et protéger contre les dommages aux tissus et aux organes ( T. Liu, Zhoug, Too, & Sun, 2017 ).

La Thymoquinone peut moduler favorablement l’expression de NF-KB pendant le sepsis (Alkharfy et al., 2015 ).

La Thymoquinone peut éviter le MODS et la mortalité due au sepsis.

La Thymoquinone peut inhiber le SARS-COV2 et interférer avec sa liaison aux récepteurs ACE2. Cela peut empêcher l’entrée et la réplication du virus à l’intérieur de la cellule hôte ( Bouchentouf & Missoum, 2020 ; Sekion, Ismail, Zihad et Abdelhak, 2020).

La Thymoquinone peut interférer avec la fixation du SRAS-COV-2 au domaine b ( SBDb ) de liaison au substrat HSPAS sur les cellules stressées et peut ainsi réduire le risque d’infection ( Elfiky, 2020).

Conclusion 

Cette orientation vers les nanoparticules est une brèche vers un monde nouveau, qui ne relèverait pas seulement de la physique classique mais aussi de la physique des champs de particules, la physique quantique.

Il paraît selon les études publiées à propos de la Thymoquinone que selon la taille des nanoparticules, différents effets bénéfiques sont observés, notamment :

• Système nerveux
• Système endocrinien
• Système cardiovasculaire
• Squelette
• Sphère psychique
  
•  

CARACTÉRISATION DES NANOPARTICULES D’HUILE DE NIGELLE: 

ASPECTS EXPERIMENTAUX

Matériels et méthodes

L’un des plus importants principes actifs de l’huile de Nigella sativa est la Thymoquinone (20-30%). La Thymoquinone offre des propriétés intéressantes dans la prise en charge de certaines viroses (20). Selon les études (21), la forme nanoparticulaire de la Thymoquinone offre davantage de résultats.

Nous avons réussi à produire des nano-émulsions stables (potentiel zêta des NPS 99,8 mv)             

d’huile totale (voir Graphique, dilutions)

Avec la solution finale nous avons imprégné de la lactose monohydrate à raison de 30 ml/ kg.

Ce produit, le Nig 5, est fabriqué par un laboratoire pharmaceutique en Tunisie. Suite à l’accord de libre vente octroyé par le ministère de la santé publique national, le Nig 5 est depuis commercialisé par un grand nombre de pharmacies. De même, en France, l’ensemble de nos produits est enregistré auprès du ministère de l’agriculture et de la souveraineté alimentaire.

En considérant 6 lignes de fabrication de Nigella sativa C5 nous avons effectué des mesures successives de chaque échantillon. Les différentes analyses et mesures ont confirmé la présence de structures nanométriques stables, dont la taille débute de 20 nm à 200 nm, mesurées et comptées avec le microscope NTA. L’appareil utilisé est NANOSIGHT NS300, CAMÉRA HAUTE SENSIBILITÉ, MODULE NS300 B488NM BLUE LASER et POMPE À SERINGUE AUTOMATIQUE.  Les graphiques ci-dessous comportent chacun six manipulations pour six mesures (le nombre de particules par ml est à multiplier par 10.000.000 (échelle E7), le maximum a été un pic à plus de 20 millions de particules/ml d’une taille particulière). Pour obtenir le nombre total de particules/ml, il faut compter toutes les tailles. La quantité des nanoparticules est de plus de 8000 Millions unités par ml du produit final dilué à 10-10 (soit Plus de 8 milliards/ml) (voir graphique (2)). Comparé à l’éthanol considéré comme témoin, ce dernier  ne présente que 600 millions de nanostructures  par ml (voir graphique (3)).  En utilisant la technique NTA (NanoTracking Analysis) on peut conclure que Nigella Sativa 5 du laboratoire Fractal est différent du solvant pur Ethanol 90% préparé de manière similaire.

Graphique (1) :

Graphique (2)

Graphique (3)

La mise en évidence des traces de cette huile sous forme de nanoparticules s’est faite avec la spectrométrie RMAN, Le FTIR (L’IRTF Thermo Scientific Nicolet iN10 a été utilisé en mode réflectance totale atténuée (ATR). Les échantillons sont mis en contact direct avec un cristal de germanium à travers lequel passe le rayonnement infrarouge. Les spectres ont été mesurés en utilisant 64 balayages à une résolution de 4 cm-1 dans la gamme de fréquences entre 600 et 4000 cm-1. Ils ont été analysés avec le logiciel Thermo Scientific™ OMNIC™ Picta™), la microscopie SEM-DEX (appareil utilisé : JEOL FEG SEM 7600F équipé d’un système EDX (Jeol JSM2300 avec une résolution < 129 eV, fonctionnant à 15 keV avec une distance de travail de 8 mm. Le temps d’acquisition des spectres chimiques était de 300 s avec un courant de sonde de 1 nA). Suite à une lyophilisation nous avons pu observer et qualifier et quantifier la composition de ces nanoparticules.

Graphique (4) : Champ des particules  dans le liquide Nigella Sativa 5

Graphique (5) : Champ des particules  dans le liquide Ethanol seul

Graphique (6) : SEM-EDX: Scanning Electron Microscope-Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy

Graphique (7) : Spectre FTIR de l’échantillon de Nigella sativa 5 (1/10)

Graphique (8) : Spectre d’un échantillon d’éthanol 90% 5C 1/10

CONCLUSION

Une comparaison entre le Nigella sativa C5 et le contrôle Ethanol 90% C5 a montré que :

• –   Le nombre de particules observées est remarquablement élevé dans ce Nigella sativa 5. Il est estimé à 8’540 millions de particules par ml, alors que pour le contrôle Ethanol 90% C on ne trouve que 600 millions de particules par ml.
• –   La taille des particules et leur distribution (SPAN) est différente pour Nigella sativa 5C (distribution plus compacte) que pour le contrôle Ethanol.
• –   Lors de la surgélation de Nigella sativa 5 on constate la formation d’une fine couche huileuse entre la glace et le verre du flacon de lyophilisation, ce phénomène est spécifique car il ne se produit pas pour le contrôle Ethanol pur 90%.
• –   La quantité de matière sèche récoltée est de 47 μg/g alors que qu’elle ne peut être mesurée et identifiée dans le flacon du contrôle Ethanol correspondant (PET).
• –   Par examen microscopique cet échantillon (SEM), on peut suspecter une composition particulière de cette matière sèche récoltée. La composition ionique (EDX) confirme cette spécificité par rapport à différents contrôles (voir Graphique (6)).

Références :

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(4) BASSIM ATT A M. 
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(14) A. Z. Wang, R. Langer, and O. C. Farokhzad, ―Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs,‖ 
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